Читать книгу - "Мозг и его «Я». Кто мы? Откуда мы? Куда мы идем? - Татьяна Владимировна Черниговская"

работы когнитивно специализированных узлов нейронной сети в бодрствующем мозге человека и животных – реконструировать когнитом по тому, нейронами с какой когнитивной специализацией и каким образом связанными обладает данный организм.

До последнего времени подобные эксперименты проводились, в основном, электрофизиологическими методами, с помощью вживленных в мозг микроэлектродов. Такое небольшое «окно» в мозг животного позволяло зарегистрировать сигналы, как правило, нескольких нейронов, редко одной-двух сотен клеток из небольшого участка мозга. Это очень ограниченные возможности для коррелятивных исследований и совсем неподходящие условия для каузальных экспериментов, в которых отдельные когнитивно специализированные нейроны должны быть подвергнуты различным воздействиям, проверяющим, возникнет ли соответствующий субъективный опыт, или можно ли его избирательно заблокировать. Поэтому в последние годы мы стали разрабатывать и использовать арсенал новых экспериментальных подходов. Вместо методов, опирающихся на электрические сигналы клетки, мы применяем генетически кодируемые зонды, детектирующие процессы внутри нервной клетки, а для слежения за этими процессами в мозге и воздействия на их применяем оптические методы.

Чтобы выявить нейроны, вовлекающиеся в когнитивные процессы, мы используем геномный ответ этих клеток на субъективную новизну. Для этого создается незнакомая для данного животного ситуация, в которой оно впервые сталкивается с новой информацией, детектируемой нервными клетками его мозга. Геномный ответ этих клеток мы выявляем по активации обнаруженных нами ранее генов, которые молчат в мозге, когда нейроны работают в штатном электрофизиологическом режиме, но как только организм сталкивается с какой-то новизной и мозг должен что-то запомнить, происходит вспышка экспрессии этих генов в соответствующих нейронах. Она нужна, чтобы клетка зафиксировала в долговременной памяти эту новую информацию – запомнила своих синаптических «соседей» в нервной сети, выступивших причиной этой необычной новой ситуации.

Но, наряду с запоминанием этого синаптического притока, нейроны ряда глубоких структур головного мозга, через данную комбинацию входов, способны запомнить и породившие этот приток факторы внешнего мира, точнее преднастроенные ожиданиями и внутренними потребностями соотношения организма с этими внешними факторами. Первый, синаптический обзор мы назовем внутренним обзором (internal purview) когнитивно специализированного нейрона, а второй – его внешним обзором (external purview).

Сегодня мы можем находить и метить в мозге такие когнитивно специализированные нейроны. Эти клетки в момент нового когнитивного эпизода экспрессируют ген c-fos, по продуктам экспрессии которого можно выявить всю эту сеть в мозге. Благодаря новым методам микроскопии мы можем с клеточным разрешением реконструировать целый мозг животного, претерпевшего эпизод нового опыта, и можем идентифицировать в нем нервные клетки, которые были вовлечены в эту когнитивную вспышку. Более того, мы можем визуализировать не только отдельные клетки, но даже их отростки, по которым можно отслеживать связи этих нейронов, то есть восстанавливать структуру всей сети.

Еще один подход, который мы развиваем в последние несколько лет, – это использование линий трансгенных животных, которые позволяют когнитивно индексировать все нейроны в мозге животного, вовлекавшегося в тот или иной когнитивный эпизод. Индексировать в данном случае означает, что мы далее на протяжении всей жизни животного можем специальными оптическими методами избирательно выявлять эти клетки и исследовать их работу.

В таких экспериментах мы используем две линии трансгенных мышей, которые скрещиваем друг с другом, получая двойных трансгенных животных. У одних в геноме – один конструкт, у других – другой, и если происходит их слияние, то это как смешать жидкости из разных сосудов, вместе они дают гремучую смесь. Каждый генетический конструкт по отдельности ничего не делает, но если мы их совмещаем при определенных условиях во время когнитивного эпизода, то все клетки, которые были вовлечены в этот эпизод, претерпевают генетическую модификацию – ДНК только тех нервных клеток, которые были активны в этом эпизоде, структурно изменяется. То есть у всех клеток этой нейронной подсети мозга теперь другой геном.

В ходе такой генетической манипуляции нам важно внести в ДНК этих клеток определенные функциональные маркеры, которых нет в геноме всех остальных нейронов и по которым мы можем выявлять и исследовать данную когнитивную группу. Например, мы вставляем в их ДНК ген флуоресцентного белка таким образом, чтобы на протяжении всей жизни животного эта сеть клеток, сработавшая во время когнитивного эпизода, стала светиться определенным цветом. С помощью такого приема мы можем избирательно увидеть эту когнитивную группу в целом мозге животного, какой бы обширной она ни была.

До сих пор я рассказывал о методах, позволяющих увидеть помеченные когнитивные группы нейронов только после смерти животного. Но в последнее время мы разработали методы прижизненного исследования когнитивно индексированных нейронных сетей мозга.

С этой целью мы, в частности, применяем методы двухфотонной in vivo микроскопии. Они основаны на использовании подходов нелинейной микроскопии, которые позволяют возбуждать флуоресценцию в строго определенных слоях ткани и осуществлять далее трехмерную реконструкцию источников этой флуоресценции. Если мы ввели в геном клетки, вовлекшейся в эпизод нового когнитивного опыта, ген флуоресцентного белка, то с помощью двухфотонной микроскопии по свечению такого белка мы увидим этот нейрон в живом мозге. Более того, по расположению сосудистого дерева вокруг клеток можно в разное время жизни животного находить одни и те же нейроны. Благодаря этому, мы можем возвращаться к ним ото дня ко дню, задавая вопрос, как они себя ведут в разных ситуациях.

Мы также можем вживлять в геном активирующихся при когнитивном эпизоде нейронов не только постоянно светящиеся флуоресцентные белки, но и сенсоры активности, флуоресценция у которых возникает, только когда нервная клетка возбуждается. Тогда мы достигаем уже двух целей. Во-первых, мы идентифицируем в мозге всю когнитивную субсеть, а во-вторых, мы вводим в эти клетки сенсор, который позволяет следить, когда и при каких условиях нейроны данной сети работают. Способен ли, условно говоря, «нейрон Билла Клинтона» реагировать и на Барака Обаму?

В описанных выше экспериментах с двухфотонной микроскопией мы вынуждены ограничивать поведение животных, закрепляя их голову под объективом микроскопа. Но в последние годы мы стали также использовать мини-микроскопы, монтируемые на голову свободно передвигающейся мыши. В этих экспериментах в мозг вживляется небольшая цилиндрическая линза, соединяемая с миниатюрным устройством на голове мыши, пропускающим через эту линзу свет определенной длины волны для возбуждения флуоресценции у генетически помеченных нейронов, которые находятся под линзой. Это изображение передается через линзу в микроскопическую камеру на голове мыши, и так мы можем регистрировать активность популяций из сотен когнитивно-индексированных нейронов в свободном поведении животного.

И, наконец, нам важно исследование не только активности нейронов этих когнитивных ансамблей во время поведения, но и того, что будет, если мы станем стимулировать нейроны этого ансамбля, сформировавшегося при приобретении конкретного субъективного опыта. Можем ли мы такой стимуляцией вызвать у животного данное состояние субъективного опыта, когда внешних условий