Читать книгу - "ДНК. История генетической революции - Джеймс Д. Уотсон"

Еще один эпохальный метод для изучения различных межбелковых взаимодействий ряд исследователей именует «интерактом». Название обозначает полный набор взаимодействий между молекулами в отдельнойклетке. Интерактом включает как непосредственные физические контакты между белками (белок-белковые взаимодействия), так и непрямые взаимодействия генов, это как минимум дважды гибридный метод. В 1989 году его разработал генетик из Университета штата Нью-Йорк в Стоуни-Брук Стэн Филдс, специализирующийся на инновационных научных технологиях, способных простимулировать научные открытия. В таком двухгибридном анализе смешиваются и стыкуются пары белков, и все происходит не на инертной матрице, а в живой дрожжевой клетке. Метод заключается в том, чтобы проанализировать взаимодействие белков in vivo в дрожжах путем связывания интересующих белков A и B с разделенными ДНК-связывающим и ДНК-активационным доменами некоторого активатора транскрипции. Конструкция «белок A + ДНК-связывающий домен» называется наживкой (bait), а конструкция «белок B + активационный домен» называется жертвой (prey). Если белки A и B взаимодействуют, то из двух фрагментов собирается функциональный активатор транскрипции, который запускает транскрипцию репортерного гена (например, вырабатывающего некий флуоресцентный белок), иначе репортерный ген не транскрибируется и сигнал не наблюдается, или, если конкретнее, когда интересующие нас белки связываются друг с другом, то активируется репортерный ген, обеспечивающий рост дрожжей.

Транскриптомика качественно расширила наши возможности в охоте на гены, провоцирующие болезни: технология микрочипов позволила выявить химическую основу конкретных заболеваний, показала различия между здоровыми и пораженными тканями как функцию экспрессии генов. Логика проста. Выполняем на микрочипе анализ экспрессии генов в обычной ткани и в раковой, находим разницу между двумя результатами, смотрим, какие гены экспрессируются в одной ткани и не экспрессируются в другой. Стоит нам определить, работа каких генов дает сбой, то есть либо недостаточна, либо чрезмерно активна, к примеру в раковой ткани, и уже можно определить мишень, а затем атаковать ее при помощи таргетной молекулярной терапии, а не неселективной химиотерапией и облучением, ведь известно что эти методы губят как больные, так и здоровые клетки.

Те же технологии позволяют различать разные формы одной и той же болезни, например раковой опухоли. Стандартная микроскопия, делающая возможной цитологические и гистологические исследования, не всегда годилась для решения такой задачи: разновидности рака, которые выглядят схоже на первый взгляд врача, могут критически различаться на молекулярном уровне. Браун, комментируя прежнюю точку зрения, в соответствии с которой все виды рака в конкретной ткани имеют один и тот же корень, говорил: «Все равно что думать, будто у любой желудочной боли одна и та же причина. Понимая различия, мы можем эффективнее лечить все эти виды рака». Например, исследования с применением ДНК-микрочипов показали чрезмерную экспрессию рецептора тирозинкиназы под названием FLT3 при некоторых формах лейкемии; такие исследования не только позволили повысить точность диагностики, но и простимулировали разработку нескольких ингибиторов FLT3, которые кажутся перспективными с клинической точки зрения.

Майкл Уиглер из лаборатории Колд-Спринг-Харбор взял на вооружение метод, при котором аккумулируется не РНК, а ДНК раковых клеток и тем самым составляется профиль генетического разнообразия опухолей. Многие виды рака обусловлены переупорядочиванием хромосом – подобное может происходить, если сегменты хромосомы случайно дублируются и возникает избыток генов, кодирующих те белки, что стимулируют клеточный рост (см. главу 14). Другие виды рака возникают из-за утраты генов, кодирующих белки-репрессоры клеточного роста. Работая по методу Уиглера, врачи делают биопсию раковых и здоровых тканей одного и того же человека. ДНК раковой ткани химически помечается красным красителем, а ДНК здоровой ткани – зеленым. Микрочипы ДНК, заправленные всеми известными человеческими генами, обрабатываются смесью из двух образцов. Как и мРНК в стандартном эксперименте с микрочипами, помеченные молекулы ДНК связываются с комплементарными последовательностями в матрице. Гены, амплифицируемые в раковых клетках, дают заметное красное окрашивание (поскольку с этим участком связывается гораздо больше молекул с красным красителем, чем с зеленым), а гены, утраченные в раковых клетках, выглядят на микрочипе как зеленые пятна (поскольку «красным молекулам» там не с чем связываться). Такие эксперименты значительно расширили список известных генов, провоцирующих рак груди и другие онкологические заболевания.

Всякий раз, когда мы беремся за лечение конкретной болезни человека, понимаем, что в значительной степени мы, по сути, бродим в потемках. Мы могли бы значительно ускорить продвижение к сути проблемы, то есть приблизиться к пониманию того, в чем именно заключается проблема и как ее разрешить, разобравшись, как именно происходит экспрессия наших генов, когда организм работает в условиях физиологической нормы. Полностью представив в динамике, как именно работает каждый из нашей 21 тысячи с лишним генов при нормальном развитии от оплодотворенной яйцеклетки до полноценной взрослой особи, мы получили бы отправную точку для понимания патогенеза любой болезни. Для дальнейшего продвижения вперед нужно достроить карту человеческой «транскриптомы». Это следующий этап постижения тайн «священного Грааля» генетики. Эксперименты с ДНК-микрочипами сыграли ключевую роль в работе по созданию полной картины активности человеческих генов, эта техника проторила путь РНК-секвенированию – адаптации высокопроизводительного изучения последовательностей.

Изучение экспрессии генов при помощи ДНК-микрочипов в ходе жизненного цикла дрожжей продемонстрировало, какая ошеломительно сложная молекулярная динамика присуща клетке при делении. В процессе участвует более восьмисот генов, и каждый активируется в строго определенный момент клеточного цикла. Здесь мы, опять же, можем сталкиваться с эволюционным «упрямством» из разряда «не чинить то, что работает»: некий биологический процесс, который однажды успешно сформировался, скорее всего, так и будет опираться на все те же базовые молекулярные механизмы до тех пор, пока не прекратится жизнь на Земле. Насколько мы можем судить, те самые белки, что управляют развитием дрожжевой клетки в ее жизненном цикле, играют весьма схожую роль в клетках человека.

В конце концов, цель всех этих «-омик» (ген-, проте-, транскрипт- и прочих) – построить полную, детализированную до отдельных молекул картину, показывающую, как формируются и функционируют живые существа. По мере того как такой холистический подход, именуемый «системной биологией», привлекает все более пристальное внимание, можно задуматься даже о компьютерном моделировании поведения отдельной клетки «in silico».

Как мы убедились, даже примитивнейшие биологические процессы отличаются огромной сложностью, и, несмотря на внушительный прогресс, достигнутый после завершения проекта «Геном человека», перед нами по-прежнему стоят не менее важные задачи. Молекулярные основы развития – это захватывающее путешествие от яйцеклетки до взрослой особи, записанное четырьмя буквами генетического алфавита, – пока лучше всего изучено на плодовых мушках, но это начало большого пути.